近日，南京大学化学学院黄硕教授在单分子肽测序领域取得了重要突破，通过首创的“边切边测”（chop and measure）策略成功实现了单氨基酸分辨率的肽序列测定。该方法突破了纳米孔肽测序信号分辨率不足的长期瓶颈，解决了传统策略中肽链运动不可控、信号均一性差的关键问题，为蛋白质组学研究提供了全新的技术路径。该成果以“Sequential reading of a stepwise shortened peptide immobilized on nanopore”为题，在线发表于国际顶级学术期刊《自然》。

研究背景

蛋白质是生命活动的核心执行者，其序列信息是解码生物过程与疾病机制的关键钥匙。然而，Edman降解和质谱等传统测序技术在检测灵敏度与动态范围上存在明显局限，难以对低丰度蛋白以及翻译后修饰进行全面、精准的分析。这一技术瓶颈推动了单分子肽测序的发展，以期实现单分子水平上肽序列的直接、高分辨率解析。

纳米孔是一种新兴的单分子测序技术，已经在核酸测序领域取得突破性进展，也为蛋白质组学研究的技术革新提供了全新的解题思路。但是，纳米孔肽测序技术的开发面临着远超核酸测序的多重挑战，不仅需要精准区分构成肽链的20种天然氨基酸与种类繁多的翻译后修饰，还需要克服肽链折叠结构与非均匀电荷分布所带来的检测困难。这些挑战对纳米孔道的空间分辨能力提出了极高的要求，同时也亟需发展更有效的测序策略，以实现肽段序列的可控、顺序读取。

研究详情

针对上述问题，研究团队另辟蹊径，开创了全新的“动态孔物成环”（简称孔物成环）（transient Pore Analyte Looping，tPAL）检测模式。研究团队通过遗传密码子扩展技术构建了首个具有双重反应位点的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）纳米孔（图1a），并对其进行了双重功能化修饰（图1b）。这种独特的检测架构有别于传统的纳米孔随机传感模式：待测肽分子的C端被共价连接在孔道下沿，其游离N端可以通过可逆配位相互作用与孔道识别区修饰的次氮基三乙酸-镍离子（NTA-Ni）适配器发生特异性结合，实现对锚定肽段N端的重复读取（图1c，d）。这种多次重读机制能够有效抵消单次测量的随机误差，大幅提升了N端识别的精准度。

图1 tPAL测量体系的构建

为实现肽段序列的顺序读取，研究团队进一步发展了基于胆固醇修饰的氨肽酶锚定策略。借助胆固醇基团与磷脂膜之间的疏水相互作用，氨肽酶被定向富集在孔道周围，从而对连接在孔道上的单条肽链进行逐个氨基酸的顺序水解。在此过程中，孔道内集成的NTA-Ni适配器能够实时识别每一步酶切后暴露出的新肽链N端，汇报出对应的特征电流信号（图2a）。这些特征电流信号在时序上的排列，直接反映了该肽段从N端到C端的序列组成信息，为肽序列的解析提供了可靠依据。为验证该方法的可行性，研究团队选取了EFEFEFC及EFTREFTREFTRC等由重复单元组成的肽段进行顺序酶切测量，成功观察到了与肽序列直接相关的周期性电流信号模式（图2b-e）。

这种基于“边切边测”策略的纳米孔肽测序方法展现出了极高的空间分辨率及广泛的适用性，不受肽链电荷状态的限制，并且能够清晰区分肽链中的单氨基酸突变。对于含有乙酰化、磷酸化等翻译后修饰或非天然氨基酸的肽段，该方法同样表现出卓越的分辨能力。在验证性实验中证实了该方法对手性肽也具备测序分析能力。

图2 基于“边切边测”策略的肽测序方法

受纳米孔核酸测序中基于k-mer的碱基识别策略的启发，结合“边切边测”方法的特性，研究团队定制开发了一套适用于多肽序列解码的机器学习算法。他们将3-mer作为基本识别单元，首先构建了一个小型的3-mer参考数据库和机器学习模型，对测序信号进行分段识别；然后通过3-mer间的序列关联构建有向连接图，重构出完整的肽序列（图3a）。使用上述数据处理算法，研究团队成功实现了ETREFTRC和KTREFTRSC的序列解析（图3b-e），验证了从纳米孔测序信号直接解析多肽序列的技术可行性。

图3 肽序列解码算法

论文信息

南京大学黄硕教授为该论文的通讯作者。南京大学博士生陈佳璐、张含含及博士后王可凡为该论文的共同第一作者。该工作得到了生命分析化学全国重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费资助项目、中国博士后科学基金会等经费支持。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10881-1